中国科学院上海生命科学研究院生物信息中心

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 专为多种来源的RNA反转录操作实验设计, 与其他反转录酶相比，具有更高的保真度。试剂盒采用具高保真属性的 Transcriptor High Fidelity反转录酶。该酶为一种混合物，含有经过基因重组的反转录酶及具校正调节功能的酶。两种酶的协同作用使得其混合酶在转录RNA模板时可以获得比其他常用转录酶高7倍的保真度；可有效转录包括mRNA, 总 RNA, 病毒RNA和体外转录RNA在内的多种来源的RNA，进行两步法RT-PCR,，可应用于以下研究领域:

克隆目的基因
转录组测序
使用大片段和全长插入片段生成cDNA 文库
基因表达分析，如RNA的剪接分析

试剂盒也经LightCycler^®和其他荧光定量PCR仪器测试，是具有高保真要求的定量RT-PCR的理想选择。试剂盒含有cDNA合成反应需要的所有成分，可应用于各种常规普通PCR 及荧光PCR仪器。此外，50个反应的包装还额外包含10个对照（control RNA和引物），可同步进行对照实验。

产品优势

提升反转录实验的准确性

优化的混合酶提供7倍于普通常用反转录酶的保真度（图1）。
借助Genome Sequencer 20 系统对几百万个碱基序列进行测定，提供真实可靠的保真数据。

提供高灵敏度、高产量和全长转录子

特有锚定oligo (dT)₁₈ 可获得最长可达到14 kb的全长转录子（图2）。
极好的产量保证。
可检测低拷贝模板，最少可转录10 pg 模板（图3）。
可转录多种模板，转录温度可达55°C，可转录复杂的模板（如：具有复杂二级结构富含GC的RNA）。

反应速度更快

大大缩短反应时间，最少只需要10分钟（图4）。
同类产品中，可率先获得实验结果（图5）。

产品描述

罗氏应用科学部最新的Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, 采用了具高保真属性的 Transcriptor High Fidelity反转录酶。该酶为一种混合物，含有经过基因重组的反转录酶及具校正调节功能的酶。两种酶的协同作用使得其混合酶在转录RNA模板时可以获得比其他常用转录酶高7倍的保真度。

Transcriptor High Fidelity 反转录混合酶可以有效转录长达14kb的模板。同时该混合酶具有的高热稳定性，以及优化的缓冲体系，使得整个转录过程可以在55°C下进行，无需添加任何的附加成分就可以解决具有复杂二级结构的高GC含量模板的转录问题；而研究表明这些辅助添加成分往往会对转录的准确性产生影响。

Transcriptor High Fidelity 反转录混合酶中的重组反转录酶来于E. coli，该酶具有依赖于RNA的DNA聚合酶活性，解旋活性及可降解RNA:DNA 杂合体中RNA的RNase H 酶活性。因此在转录后，无需再特别加入RNase H，减少操作时间的同时也降低了实验成本。

Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit中包含了所有在第一链cDNA合成反应过程中所需成分。试剂盒支持三种不同引物系统下的反转录过程，即随机引物、锚定oligo(dT)₁₈和特异性基因引物，试剂盒中提供了随机引物和独有的锚定oligo(dT)₁₈ 两种引物，用户可根据自己的需要任意选择。其中锚定oligo(dT)₁₈可保证引物结合在poly(A) 尾的起始位置，有效避免引物结合在poly(A) 尾的中间位置，进而获得全长cDNAs。使用普通的oligo(dT)引物反转录长片段的mRNA时，其5’端的序列往往会不完全；而该试剂盒中的锚定oligo(dT)₁₈可保证全长cDNA的获得，可成为多种下游研究应用的首选。试剂盒中提供的六聚物随机引物则可结合在全长RNA上，延伸后获得全部RNA的序列，可用以转录不带有poly(A)尾的RNA。试剂盒还特别提供了热稳定性的RNA酶抑制剂Protector RNase Inhibitor，可保护RNA在高温下不被降解。

背景信息

cDNA合成过程中常用的反转录酶与其他核酸分析实验技术中使用的DNA聚合酶相比，往往具有更高的错误率。这会造成明显的碱基错配或是编码子移动，而这些错误会在后继的PCR反应中被进一步放大。具有校正功能的高保真PCR酶已经具有很多年的历史，而本次罗氏应用科学部推出的全新高准确性反转录酶则进一步合成高产量全长cDNA。

高突变率是反转录病毒复制的特点。该特点起源于病毒编码反转录酶的基因组复制机制，复制可以将病毒RNA转变成双链DNA。在这个反转录过程中，复制错误的出现概率很高。一种目前可以被接受的解释是反转录酶缺少的3’-5’ 外切酶活性，导致了此种现象的发生。反转录酶自然存在的高错误率阻碍了多种的应用。

产品组成

1. Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase (blend of a recombinant reverse transcriptase and a proofreading mediating enzyme)

2. Transcriptor High Fidelity Reaction Buffer, 5x concentrated

3. Protector RNase Inhibitor

4. dNTP mix, PCR-grade

5. Anchored-oligo (dT)₁₈Primer

6. Random Hexamer Primer

7. DTT

8. Water, PCR-grade

9. Control RNA – total RNA fraction purified from the immortalized cell line K-562*

10. Control PBGD primer mix (forward and reverse primer)*

* 仅在50个反应的产品包装里提供

实验数据

图 1: Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase和常用MMLV反转录酶的准确性比较。使用Genome Sequencer 20 System 测定反转录酶的错误率。分别使用Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase 和MMLV 反转录酶转录模板RNA，合成的cDNA纯化后使用具有校正功能的聚合酶进行扩增的，去除带有同样序列的质粒对照PCR扩增中的错配率，计算得到反转录过程中的错配率。Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase的错配率来自4磁独立实验的平均值，至少对3.1 x 10⁶ 碱基序列进行了测定。对 MMLV 反转录酶，测定了4.5 x 10⁶ 个碱基序列。

图 2: 比较不同反转录酶对不同片段大小的总RNA的反转录效果。使用不同的反转录酶依照制造商的建议对总RNA进行反转录（从1 µg 的人肌肉总RNA 中扩增2.3 kb片段，从1 µg HeLa 总RNA中扩增5.3 kb和 9.4 kb 片段, 从2 µg 鼠脑总RNA中扩增12.4 kb片段），取5 µl cDNA反应产物使用罗氏Expand Long Range dNTPack 产品进行扩增。

图 3: 对多种浓度模板的高效转录。使用锚定oligo(dT)₁₈引物分别转录1 µg 到 10 pg的K562总RNA，使用UPL探针在 LightCycler^®2.0 荧光定量PCR仪器上检测ß-肌动蛋白。

图 4: 使用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit ，比较不同孵育时间下的转录效果。50°C 下对1 µg HeLa 总RNA进行反转录。取5 µl 的cDNA反应产物使用罗氏Expand Long Range dNTPack扩增 8.5 kb 片段，所有的实验均进行重复实验。

图 5: 使用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit可率先获得实验结果。 Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit想对另一供应商（Supplier I）提供的含RNase H- 的M-MuLV 反转录酶的 cDNA Synthesis Kit相比实验时间缩短了近1个小时。